Wang等在《FrontiersinMicrobiology》发表了一篇题为“TranscriptomeAnalysisRevealsAI-2RelevantGenesofMulti-DrugResistantKlebsiellapneumoniaeinResponsetoEugenolatSub-MIC”的研究文章，通过原核转录组测序及qPCR技术揭示了丁香酚对群体感应（QS）的抑制机制。文章涉及的测序及分析内容在美吉生物均可轻松实现。下面小编就带大家一起看下这篇文章的精彩内容！

文章简介

英文题目：TranscriptomeAnalysisRevealsAI-2RelevantGenesofMulti-DrugResistantKlebsiellapneumoniaeinResponsetoEugenolatSub-MIC

中文题目：转录组分析揭示多重耐药肺炎克雷伯菌AI-2相关基因对Sub-MIC丁香酚的应答

发表杂志：FrontiersinMicrobiology

影响因子：4.

组学技术：原核转录组测序

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)是一种条件致病菌，能引起肺炎、败血症和尿道炎症。随着抗生素的广泛使用，耐多药和高毒力肺炎克雷伯菌分离株日益增加。有报道表明群体感应信号分子AI-2参与了其毒力相关因子、运动性、分泌系统和调节蛋白的表达调控，而丁香酚能够抑制这一过程，但目前还没有相关的转录水平上的研究。

因此，本研究分析了临床分离的肺炎克雷伯菌株在指数期用丁香酚处理后的转录水平变化以及与AI-2的相互作用，旨在更好地了解丁香酚的QS抑制机制。

1、药敏试验

肺炎克雷伯菌对17种常用抗生素中的三种有抗药性：阿莫西林，阿奇霉素和奥沙西林。说明肺炎克雷伯菌分离株有多重耐药表型，且主要对β-内酰胺类抗生素有耐药性。

2、转录组测序和DEGs聚类

总共检测到个参考基因，对照组（未添加丁香酚）中已知基因数为（78.11％），丁香酚处理组中为（78.92％）。基于FDR阈值≤0.05和

log2FC

1，确定了个重要的差异表达基因（DEGs）。其中，丁香酚处理组与对照组相比，个基因上调，个基因下调。

图1(A)上调和下调基因火山图、(B)处理组(EK1)与对照组(CK1)的DEGs

3、DEGs的功能注释和路径分析

丁香酚处理组与对照组相比，共有77个GOterm富集，包括39个生物过程，6个细胞成分和32个分子功能。与对照组相比，经丁香酚处理后肺炎克雷伯菌中基因表达上调或下调，说明不同的基因本体间存在不同的分子间相互作用。

图2GO注释的差异基因

4、KEGG通路分析

在显著富集的前20的通路中，有60个DEGs属于ABC转运蛋白，40个DEGs富集于负责信号转导的双组分系统通路。此外，TCA循环、硫代谢、ABC转运蛋白和双组分系统是最显著富集的通路，P值和Q值均0.05。其余DEGs主要富集于代谢通路，且基因表达上调。总之，丁香酚影响细菌代谢通路，这可能进一步抑制AI-2分子的产生和生物膜的形成。

图3KEGG通路中DEGs的富集统计

5、基因表达谱分析

通过qPCR分析验证DEGs在细菌中的表达谱。如图4所示，选择参与AI-2产生的基因作为qPCR分析的靶标。luxS，pfs（mtnn）和lsrK经qPCR验证的相对表达量，与fpkm趋势一致；而添加丁香酚组的lsrR相对表达量明显高于对照组，但fpkms间差异不大。尽管qPCR和RNA-seq肺炎克雷伯菌的FC值略有不同，但总体表达趋势是一致的。

图4AI-2相关基因的相对表达量

6、AI-2合成抑制试验

通过测量AI-2同时生成的同型半胱氨酸来评估体外合成的AI-2。与对照组相比，添加最低抑制浓度（MIC）的丁香酚能显著抑制AI-2的产生（P=0.）。丁香酚经1/2MIC和1/4MIC处理后，同型半胱氨酸的吸光度降低，但差异不显著，说明AI-2水平较低。上述结果表明，丁香酚可以与LuxS和Pfs（MtnN）相互作用，从而干扰AI-2的产生，该作用呈现剂量依赖性。此外，该结果与转录组测序和qPCR结果一致，进一步表明丁香酚对肺炎克雷伯菌AI-2和群体感应系统的抑制作用。

该研究利用转录组测序技术结合qPCR实验验证，揭示了sub-MIC丁香酚处理下的肺炎克雷伯菌临床分离株的转录谱，为阐明丁香酚对肺炎克雷伯菌的抑制作用机制提供了基础。

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